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        Presens傳感器插頭在微流體中的應用

        點擊次數:382 發布時間:2022-08-25

        在這項研究中,我們假設傳感器系統可用于小膠質細胞代謝的無創實時監測,以進一步闡明動態微環境下特定表型的極化水平。我們設計并制造了一種微流控芯片,用于在連續流動下培養小膠質細胞,并將氧氣和 pH 值的變化與激活后的極化狀態相關聯。

        炎癥是由外來抗原、病原體和化學物質等刺激引發的一系列復雜事件。它在多種疾病中發揮關鍵作用,例如自身免疫性疾病、癌癥和傷口愈合過程 [1]。巨噬細胞和小膠質細胞由于其抗原呈遞、吞噬作用和免疫調節特性而分別在炎癥和神經炎癥中發揮重要作用 [2]。小膠質細胞作為巨噬細胞的一種亞型,在神經免疫反應中也像巨噬細胞一樣發揮作用 [3]。根據它們在生理微環境中暴露的信號,小膠質細胞可以轉化為兩種不同的表型,稱為 M1 和 M2 [4]。也稱為“經典激活”的促炎 M1 小膠質細胞可以由脂多糖 (LPS) 誘導,而 IL-4 和 IL-13 誘導“交替激活”抗炎 M2 表型 [5,6]。為了響應對 M1 表型的刺激,已顯示巨噬細胞和小膠質細胞中發生代謝變化。在 LPS 刺激期間,產生的一氧化氮 (NO) 會抑制氧化磷酸化,從而導致細胞轉為糖酵解。由于這種反應,乳酸產量增加,這反過來又增加了細胞外酸化率 (ECAR)。監測 pH 值的變化可以深入了解細胞和組織的生理和代謝狀態 [7]。小膠質細胞的極化狀態通??梢酝ㄟ^基因表達、細胞表面標志物和釋放到培養基中或在細胞外基質中積累的蛋白質來檢測。在這方面PCR、流式細胞儀、ELISA 和 Western Blotting 是尤為常見的方法之一,它們具有侵入性、費力且耗時。這些技術也不能提供關于極化狀態變化的洞察力和實時監測。體外 實驗。微流控芯片上的器官系統通過為異質細胞群提供具有動態培養模型的 3D 分層架構,提供了出色的體外 平臺來模擬復雜的器官/組織。先前已經報道了具有復雜病因的疾病的神經炎癥模型,這進一步突出了生物工程微環境的優勢[8]。

        材料與方法

        微流控芯片由聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 制成,因為它具有柔韌性,便于插入傳感器插頭和密封泄漏。為了制造芯片的 PDMS 組件,PDMS 分別用 1:10 的固化劑和 PDMS 混合物澆鑄在聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 模具上。在真空下脫氣后,將模具在 80 ºC 下烘烤一小時,然后從模具中切出碎片。芯片 A 是一種混合芯片,包括 PMMA 和 PDMS 組件。芯片的底部包含一個用于 3D 培養和流體流動的通道,在這些層上帶有一個 PDMS 層,帶有入口、出口和傳感器插頭端口。有一個額外的 PMMA 層包圍了芯片,為光纜提供結構支撐,從而促進螺栓的壓縮。所有這些層都在 6 個螺栓的幫助下結合在一起(圖 1C)。芯片 B 有兩層。在軟光刻之后,將制造的 PDMS 組件等離子結合到顯微鏡載玻片上。鍵合后,將這些芯片放置在 120°C 的熱板上 2 小時以增強鍵合強度。

        圖 1:用于 3D 和 2D 小膠質細胞極化的兩種不同制造的微流控芯片的圖像。用于 3D 細胞培養的芯片 A 的設計:A) AutoCAD 圖紙,尺寸以 [mm] 為單位,B) 芯片 A 從上到下的層數,C) 帶有藍色染料和傳感器插頭假人的芯片 A 的圖像,芯片 B 的設計用于2D 細胞培養:D) 芯片 B 的尺寸,E) 芯片 B 的層數,F) 帶有紅色染料和傳感器插頭假人的芯片 B 的圖像。 N9小鼠小膠質細胞系用于巨噬細胞極化實驗。使用完全 RPMI(無酚)培養基 1640(補充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/鏈霉素 (Pen/Strep))進行細胞擴增。將細胞培養至 80% 融合并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收獲。用高細胞密度 (4.5 x 10 5細胞/cm 2 )接種乙醇滅菌的芯片,并在靜態條件下在 37 °C 和 5% CO 2下孵育過夜。

        一旦小膠質細胞粘附并形成單層培養物,就使用注射泵(哈佛儀器)以 0.5 µl/min 的連續流量進行管理(圖 2)。用 300 ng/ml 脂多糖 (LPS) 將小膠質細胞極化為 M1 樣表型 24 小時。在整個研究過程中,未刺激的細胞用作對照組。將微流控芯片放置在細胞培養箱中,并將傳感器插頭連接到光纖電纜。收集氧氣和 pH 傳感器測量值 24 小時。在數據采集過程中,沒有打開培養箱以避免任何氣體和溫度波動。

        圖 2:實驗裝置:A) 連接到光纖儀表和計算機的傳感器圖像,B) 注射泵和芯片的圖像,C) 培養箱內的芯片和連接的光纜。

        圖 2:實驗裝置:A) 連接到光纖儀表和計算機的傳感器圖像,B) 注射泵和芯片的圖像,C) 培養箱內的芯片和連接的光纜。

        在微流控芯片中動態培養 24 小時后,將含有 15 µM 二硫蘇糖醇 (DTT) 的裂解緩沖液移液到通道中以裂解細胞。收集裂解物并儲存在-80°C 用于 RNA 分離。使用 Macherey-Nagel RNA 分離試劑盒分離 RNA。通過 qPCR 分析根據其 TNFα、IL-6 和 iNOS 基因表達水平比較對照組和 M1 組。

        在 24 小時孵育期間從微流控芯片出口收集的上清液用于 ELISA。Affymetrix eBioscience 小鼠 TNFα 試劑盒已根據制造商說明使用。為了驗證我們的傳感器讀數并確認 M1 極化,我們確定了對照組和 M1 組釋放的 TNFα 水平。

        結果

        溶解氧顯示 LPS 刺激的小膠質細胞和未刺激的對照組減少。雖然在兩種情況下都有類似的趨勢,但在 24 小時的刺激期間,M1 極化小膠質細胞的氧水平低于對照。對于 LPS 刺激的細胞,對照的溶解氧水平降低了 22.2% 和 29.5%(圖 3A)。在 pH 監測芯片中,pH 水平在 24 小時內下降,其中對照的最終值為 6.8,LPS 刺激細胞的最終值為 6.5。

        圖 3:24小時刺激期間O 2和 pH 曲線的傳感器數據。A) 對照和 LPS 刺激細胞的 O 2 % 變化,B) 對照和 LPS 刺激細胞的 pH 變化。

        在 24 小時結束時對 TNFα、IL-6 和 iNOS 的基因表達分析顯示了顯著的倍數變化,證實了動態微流體培養下 LPS 刺激的小膠質細胞的 M1 極化。ELISA 測定表明從 LPS 刺激的細胞 (M1) 釋放的 TNFα 細胞因子顯著增加。在動態條件下 24 小時后的 TNFα 濃度測量為未刺激的對照為 102 pg/ml,LPS 刺激的小膠質細胞為 470 pg/ml。

        圖 4:對照和 LPS 刺激細胞的 mRNA 表達。A) 對照和 LPS 刺激細胞的 TNFα mRNA 表達,B) 對照和 LPS 刺激細胞的 IL-6 mRNA 表達,C) 對照和 LPS 刺激細胞的 iNOS mRNA 表達。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。P 值是從雙尾學生 t 檢驗計算的。

        圖 5:從對照和 LPS 刺激的芯片出口收集的培養基的 TNFα 濃度水平 (pg/ml)。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。P 值是從雙尾學生 t 檢驗計算的。

        討論

        本研究的最初目的是觀察 3D 培養中極化過程中小膠質細胞發生的代謝變化。為此,我們設計并制造了用于 3D 動態培養的芯片 A,并刺激細胞向 M1 表型發展。我們觀察到,與 2D 培養相比,3D 培養中的細胞沒有有效極化。我們得出結論,成功極化的細胞數量較少可能不足以改變整體代謝測量。為了證明新型傳感系統在微流體研究中的優勢,我們專注于更傳統的二維培養,并與文獻討論了結果。因此,我們決定在微流控芯片內進行二維動態單層培養。這些結果也促使我們將微流控芯片 A 改為芯片 B。經過 24 小時的刺激,我們通過 qPCR 分析確保 M1 極化的成功。典型 M1 狀態標志物 TNFα、IL-6 和 iNOS 的 mRNA 表達水平顯著高于對照組。接下來,我們展示了受刺激的細胞實際上完成了從 mRNA 到蛋白質水平的翻譯過程。為此,我們通過執行 ELISA 測定了微流控芯片出口處分泌的 TNFα 蛋白的水平。

        pH 變化與文獻一致:在之前的幾項研究中,M1 極化已被證明會導致 pH 水平降低,因為受刺激的細胞具有更高的 ECAR。在我們的研究中,與對照芯片相比,我們能夠觀察到 LPS 刺激芯片內的 pH 值要低得多。但是當我們查看芯片的初始 pH 值時,它們是不同的。這可能是由于微通道內的氣泡形成。氣泡會影響芯片介質內的溶解氣體濃度,而溶解氣體會改變介質的 pH 值。CO 2通過降低 pH 值來影響介質,另一方面,如果介質暴露于富含氧氣的氣體中,則介質的 pH 值會增加。如果對照介質暴露于 O 2豐富的氣泡,這可以解釋較高的 pH 值。這種差異還有另一種可能性。設置實驗和開始測量大約需要 40 分鐘。在測量開始之前將細胞暴露于刺激因子。這可能是由于 LPS 刺激的細胞在刺激后通過 iNOS 的形成降低了培養基的 pH 值[7]。

        O 2水平與文獻不符:N9 小膠質細胞的 LPS 刺激降低了增殖率并改變了細胞代謝,使其成為糖酵解依賴性。細胞代謝的這些變化導致耗氧量降低,并且由于細胞周期停滯 [9] 與相對較低的細胞數量相結合,LPS 刺激細胞的溶解氧水平測量值預計將高于對照,并且必須具有增加的趨勢24小時刺激。我們的結果顯示 LPS 刺激細胞的氧水平降低了 7%。必須進行更多的實驗以更好地理解為什么會出現這種與文獻的分歧。

         

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